The mitochondrial citrate carrier (CIC) encoded by the SLC25A1 gene, catalyzes the export of citrate from mitochondria to the cytosol where it is broken into into acetyl-CoA and oxaloacetate. By exome sequencing we identified for the first time two pathogenic SLC25A1 variants in a patient that suffered from a severe neurodevelopmental syndrome (Edvardson et al. 2013 J Med Genet 50:240-5). Recessive mutations in SLC25A1 have been since identified in more than a dozen patients and CIC deficiency has been classified as an inborn disorder of metabolism (OMIM: 615182) whose hallmark is combined D-2- and L-2-hydroxyglutaric aciduria (Nota et al. 2013 Am J Hum Genet 92:627-31). More recently we reported a novel homozygous mutation in the SLC25A1 gene in an affected sib pair. Both patients presented with myasthenia and impaired neuromuscular junction (NMJ) transmission whilst no neurodevelopment disorder has been observed (Chaouch et al. 2014 J Neuromuscul Dis 1:75-90). Functional analysis of the pathogenic mutations has been performed upon reconstitution of recombinant proteins into liposomes. Interestingly, the newly identified mutation caused a milder activity impairment than the previously reported mutations suggesting a fundamental role of CIC in neuromuscular transmission whose defect was previously masked by the harsher phenotypes. In preliminary experiments, knocking down the SLC25A1 orthologues by injection of antisense morpholino oligonucleotides in zebrafish embryos we observed short and erratic outgrowth of motor axons toward muscle fiber at NMJ suggesting that transmission impairment could be related to pre-synaptic nerve terminal abnormalities. Using the CRISPR/CAS9 approach we obtained stable lines of Caenorhabditis elegans knocked-out in the SLC25A1 ortholog that showed resistance to levamisole, a nicotinic acetylcholine receptor agonist, that causes continued stimulation of the worm muscles, leading to paralysis. This phenotype was, at least in part, rescued by the expression of wild-type SLC25A1 under the control of a neuron-specific promoter, strongly pointing towards a underlying pre-synaptic defect. Altogether these data demonstrate a conserved role of CIC in neuromuscular transmission. Of note, signal transmission at NMJ relies on massive synthesis in motor neurons of acetylcholine from choline and acetylCoA. While the former can be recycled after neurotransmitter release and breakdown, the latter must be continuously generated by oxidative metabolism in mitochondria from which it is exported in the form of citrate by CIC. Furthermore, our results validate the worm C. elegans as an animal model suitable for further study of the molecular and cellular underpinnings of the NMJ transmission defect associated to CIC deficiency.

Il carrier mitocondriale del citrato (CIC), codificato dal gene SLC25A1, catalizza il trasporto del citrato dalla matrice mitocondriale al citoplasma dove il citrato viene scisso in acetil-CoA e ossalacetato. Mediante sequenziamento dell’esoma, abbiamo identificato per la prima volta due varianti patogeniche del gene SLC25A1 in un paziente affetto da una grave sindrome del neurosviluppo (Edvardson et al. 2013 J Med Genet 50:240-5). In seguito, mutazioni recessive dello stesso gene sono state identificate in numerosi pazienti e la deficienza del carrier del citrato è stata classificata come un disturbo congenito del metabolism (OMIM: 615182) caratterizzato da aciduria dovuta all’accumulo dell’acido D-2- e L-2-idrossiglutarico (Nota et al. 2013 Am J Hum Genet 92:627-31). Più recentemente, abbiamo identificato una nuova mutazione omozigote del gene SLC25A1 in una coppia di fratelli che mostravano sintomi clinici di miastenia e difetti nella trasmissione nervosa a livello delle giunzioni neuromuscolari ma senza apparenti segni di disturbi del neurosviluppo (Chaouch et al. 2014 J Neuromuscul Dis 1:75-90). Abbiamo quindi analizzato in vitro l’effetto delle mutazioni patogeniche sulla funzione del trasportatore del citrato a seguito di espressione ricombinante e ricostituzione in vescicole lipidiche artificiali. Abbiamo così dimostrato che la nuova mutazione causava un effetto meno drastico sull’attività del trasportatore suggerendo che CIC giochi un ruolo fondamentale nella trasmissione muscolare il cui difetto non era stato precedentemente notato negli altri pazienti a causa della maggiore gravità del fenotipo. Allo scopo di indagare sulle conseguenze neurologiche della deficienza di CIC, in esperimenti preliminari abbiamo ridotto l’espressione dei geni ortologhi di SLC25A1 in zebrafish iniettando nell’embrione oligonucleotidi antisenso del tipo “morfolino”. In questo modo abbiamo potuto osservare nell’animale adulto una alterata morfologia degli assoni a livello delle giunzioni neuromuscolari che ci hanno portato a proporre che i difetti della trasmissione neuromuscolare osservati nei pazienti potessero avere origine in anomalie delle terminazioni nervose pre-sinaptiche. Facendo uso della tecnologia CRISPR/CAS9, abbiamo generato linee stabili di Caenorhabditis elegans in cui il gene ortologo di SLC25A1 è stato inattivato. I vermi geneticamente modificati risultano essere particolarmente resitestenti ad un farmaco, il levamisolo, che agendo come un agonista del recettore di tipo “nicotinico” dell’acetilcolina causa una continua stimolazione della fibra muscolare del verme fino a determinarne la paralisi. Questo fenotipo può essere, almeno in parte, corretto dall’espressione del gene SLC25A1 “wild-type” (cioè senza mutazioni) sotto il controllo di un elemento di regolazione trascrizionale che ne permette l’espressione solamente nei neuroni, Questa osservazione fornisce un ulteriore evidenza della compromissione della trasmissione neuromuscolare a livello pre-sinaptico associati alla disfunzione di CIC. Nel loro complesso, i dati ottenuti dimostrano che CIC ha un ruolo nella trasmissione muscolare conservato nel corso dell’evoluzione. A questo proposito, giova ricordare che la trasmissione dei segnali nervosi a livello delle giunzioni neuromuscolari necessita di una continua e massiccia sintesi di acetilcolina nei motoneuroni a partire da colina e acetil-CoA. Mentre il primo composto può essere riciclato dopo il rilascio e l’idrolisi del neurotrasmettitore, il secondo deve essere continuamente generato dal metabolismo ossidativo nei mitocondri dai quali esce sotto forma di citrato grazie a CIC. I nostri risultati, inoltre, validano il verme C. elegans come un modello animale utile per ulteriori indagini sui meccanismi molecolari e cellulari alla base dei difetti della trasmissione nervosa a livello delle giunzioni neuromuscolari associati alla deficienza di CIC.

Molecular and cellular underpinnings of the neurological phenotypes associated to mitochondrial citrate carrier (SLC25A1) deficiency

SCARCIA, PASQUALE;PORCELLI, VITO;GORGOGLIONE, RUGGIERO;PALMIERI, Luigi
2017-01-01

Abstract

The mitochondrial citrate carrier (CIC) encoded by the SLC25A1 gene, catalyzes the export of citrate from mitochondria to the cytosol where it is broken into into acetyl-CoA and oxaloacetate. By exome sequencing we identified for the first time two pathogenic SLC25A1 variants in a patient that suffered from a severe neurodevelopmental syndrome (Edvardson et al. 2013 J Med Genet 50:240-5). Recessive mutations in SLC25A1 have been since identified in more than a dozen patients and CIC deficiency has been classified as an inborn disorder of metabolism (OMIM: 615182) whose hallmark is combined D-2- and L-2-hydroxyglutaric aciduria (Nota et al. 2013 Am J Hum Genet 92:627-31). More recently we reported a novel homozygous mutation in the SLC25A1 gene in an affected sib pair. Both patients presented with myasthenia and impaired neuromuscular junction (NMJ) transmission whilst no neurodevelopment disorder has been observed (Chaouch et al. 2014 J Neuromuscul Dis 1:75-90). Functional analysis of the pathogenic mutations has been performed upon reconstitution of recombinant proteins into liposomes. Interestingly, the newly identified mutation caused a milder activity impairment than the previously reported mutations suggesting a fundamental role of CIC in neuromuscular transmission whose defect was previously masked by the harsher phenotypes. In preliminary experiments, knocking down the SLC25A1 orthologues by injection of antisense morpholino oligonucleotides in zebrafish embryos we observed short and erratic outgrowth of motor axons toward muscle fiber at NMJ suggesting that transmission impairment could be related to pre-synaptic nerve terminal abnormalities. Using the CRISPR/CAS9 approach we obtained stable lines of Caenorhabditis elegans knocked-out in the SLC25A1 ortholog that showed resistance to levamisole, a nicotinic acetylcholine receptor agonist, that causes continued stimulation of the worm muscles, leading to paralysis. This phenotype was, at least in part, rescued by the expression of wild-type SLC25A1 under the control of a neuron-specific promoter, strongly pointing towards a underlying pre-synaptic defect. Altogether these data demonstrate a conserved role of CIC in neuromuscular transmission. Of note, signal transmission at NMJ relies on massive synthesis in motor neurons of acetylcholine from choline and acetylCoA. While the former can be recycled after neurotransmitter release and breakdown, the latter must be continuously generated by oxidative metabolism in mitochondria from which it is exported in the form of citrate by CIC. Furthermore, our results validate the worm C. elegans as an animal model suitable for further study of the molecular and cellular underpinnings of the NMJ transmission defect associated to CIC deficiency.
2017
Il carrier mitocondriale del citrato (CIC), codificato dal gene SLC25A1, catalizza il trasporto del citrato dalla matrice mitocondriale al citoplasma dove il citrato viene scisso in acetil-CoA e ossalacetato. Mediante sequenziamento dell’esoma, abbiamo identificato per la prima volta due varianti patogeniche del gene SLC25A1 in un paziente affetto da una grave sindrome del neurosviluppo (Edvardson et al. 2013 J Med Genet 50:240-5). In seguito, mutazioni recessive dello stesso gene sono state identificate in numerosi pazienti e la deficienza del carrier del citrato è stata classificata come un disturbo congenito del metabolism (OMIM: 615182) caratterizzato da aciduria dovuta all’accumulo dell’acido D-2- e L-2-idrossiglutarico (Nota et al. 2013 Am J Hum Genet 92:627-31). Più recentemente, abbiamo identificato una nuova mutazione omozigote del gene SLC25A1 in una coppia di fratelli che mostravano sintomi clinici di miastenia e difetti nella trasmissione nervosa a livello delle giunzioni neuromuscolari ma senza apparenti segni di disturbi del neurosviluppo (Chaouch et al. 2014 J Neuromuscul Dis 1:75-90). Abbiamo quindi analizzato in vitro l’effetto delle mutazioni patogeniche sulla funzione del trasportatore del citrato a seguito di espressione ricombinante e ricostituzione in vescicole lipidiche artificiali. Abbiamo così dimostrato che la nuova mutazione causava un effetto meno drastico sull’attività del trasportatore suggerendo che CIC giochi un ruolo fondamentale nella trasmissione muscolare il cui difetto non era stato precedentemente notato negli altri pazienti a causa della maggiore gravità del fenotipo. Allo scopo di indagare sulle conseguenze neurologiche della deficienza di CIC, in esperimenti preliminari abbiamo ridotto l’espressione dei geni ortologhi di SLC25A1 in zebrafish iniettando nell’embrione oligonucleotidi antisenso del tipo “morfolino”. In questo modo abbiamo potuto osservare nell’animale adulto una alterata morfologia degli assoni a livello delle giunzioni neuromuscolari che ci hanno portato a proporre che i difetti della trasmissione neuromuscolare osservati nei pazienti potessero avere origine in anomalie delle terminazioni nervose pre-sinaptiche. Facendo uso della tecnologia CRISPR/CAS9, abbiamo generato linee stabili di Caenorhabditis elegans in cui il gene ortologo di SLC25A1 è stato inattivato. I vermi geneticamente modificati risultano essere particolarmente resitestenti ad un farmaco, il levamisolo, che agendo come un agonista del recettore di tipo “nicotinico” dell’acetilcolina causa una continua stimolazione della fibra muscolare del verme fino a determinarne la paralisi. Questo fenotipo può essere, almeno in parte, corretto dall’espressione del gene SLC25A1 “wild-type” (cioè senza mutazioni) sotto il controllo di un elemento di regolazione trascrizionale che ne permette l’espressione solamente nei neuroni, Questa osservazione fornisce un ulteriore evidenza della compromissione della trasmissione neuromuscolare a livello pre-sinaptico associati alla disfunzione di CIC. Nel loro complesso, i dati ottenuti dimostrano che CIC ha un ruolo nella trasmissione muscolare conservato nel corso dell’evoluzione. A questo proposito, giova ricordare che la trasmissione dei segnali nervosi a livello delle giunzioni neuromuscolari necessita di una continua e massiccia sintesi di acetilcolina nei motoneuroni a partire da colina e acetil-CoA. Mentre il primo composto può essere riciclato dopo il rilascio e l’idrolisi del neurotrasmettitore, il secondo deve essere continuamente generato dal metabolismo ossidativo nei mitocondri dai quali esce sotto forma di citrato grazie a CIC. I nostri risultati, inoltre, validano il verme C. elegans come un modello animale utile per ulteriori indagini sui meccanismi molecolari e cellulari alla base dei difetti della trasmissione nervosa a livello delle giunzioni neuromuscolari associati alla deficienza di CIC.
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