Studio sui processi di proliferazione cellulare e metastatizzazione in nuove linee cellulari di melanoma.

Introduzione: Il melanoma maligno è oggi considerato una patologia emergente a causa dell’aumento costante dell'incidenza e dell’assenza di terapie efficaci nel trattamento dei pazienti con melanoma metastatico. Esistono inoltre sempre maggiori evidenze in letteratura relative alla complessità dei meccanismi molecolari legati all'insorgenza e alla progressione della malattia. Nel melanoma familiare è ormai certo che mutazioni dei geni CDK4 ed CDKN2A giocano un ruolo fondamentale. Nel melanoma sporadico invece la letteratura non fornisce ancora certezze nonostante questo tipo di melanoma risulti essere più rappresentato nella popolazione. Obiettivi: Nonostante l'eterogeneità dell'assetto genetico, nei pazienti affetti da melanoma si mira all’individuazione di eventuali correlazioni tra le vie cellulari coinvolte e la biologia della malattia al fine di fornire informazioni di supporto nella messa punto di nuove target therapy. È stato condotto uno studio di genotipizzazione di alcuni dei geni coinvolti nella suscettibilità al melanoma e di caratterizzazione di alcune vie di regolazione della melanogenesi, della proliferazione cellulare e della adesione cellulare (MC1R, RAS/RAF/MAPK, βcatenine) in tre nuove linee cellulari di melanoma sporadico (hmel1, hmel9, hmel11) isolate nei nostri laboratori. I risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli ottenuti su linee cellulari di controllo (HBL, LND1). Risultati: L’attività della tirosinasi, enzima chiave della melanogenesi, nelle linee cellulari isolate da melanoma sporadico, correla solo parzialmente con il livello di espressione del gene della tirosinasi e non correla col genotipo MC1R e la densità del suddetto recettore a livello della membrana plasmatica. Le nuove linee cellulari non presentano mutazioni di MC1R nonostante la trasduzione del segnale ad esso correlata risulti compromessa. Questo dato ci suggerisce che un signalling difettoso può essere più frequente di quanto ipotizzabile in relazione al genotipo MC1R. Nelle stesse linee, il gene BRAF risulta invece mutato al residuo V600 con conseguente fosforilazione e attivazione costitutiva di ERK. Le linee cellulari di controllo sono wild type (wt) per i geni MC1R e BRAF. Questo dato è a sostegno dell’ipotesi di un coinvolgimento del pathway di RAS/RAF/MAPK nella genesi del melanoma. Sono stati inoltre analizzati i livelli e la localizzazione subcellulare delle βcatenine. Esse presentano una diversa localizzazione nelle linee cellulari provenienti da melanoma sporadico (membrana/citoplasma), rispetto alle linee di melanoma controllo (nucleo/citoplasma). Questo suggerisce un diverso ruolo di tali proteine nell’adesione cellula-cellula o nella proliferazione delle diverse linee cellulari. Lo studio da noi condotto ha inoltre evidenziato l’assenza di correlazione tra il livello e la distribuzione delle βcatenine e il trattamento con NDP-MSH e il pathway di RAS / RAF / MAPK. Studi di sequenziamento delle βcatenine hanno poi consentito di riscontrare mutazioni nelle linee cellulari HBL, LND1 e hmel1 che sono estratte da metastasi cutanee di melanoma. Nella linea hmel1 la mutazione porta alla sostituzione di Trp383 con Cys383. Questa mutazione non è mai stata descritta in letteratura. Conclusioni: Le nuove linee cellulari presentano una compromissione del pathway del cAMP pur esprimendo un MC1R wt. Tale alterazione è stata precedentemente descritta in linee cellulari con attivazione costitutiva del pathway RAS/RAF/MAPK. I nostri risultati confermano l’associazione tra mutazione di BRAF e disaccoppiamento funzionale di MC1R con la produzione di cAMP. Secondo quanto riportato in letteratura, le βcatenine hanno un ruolo importante nel determinare l’aggressività del melanoma. Il sequenziamento delle βcatenine ha consentito di individuare la mutazione Trp383 → Cys383 che sembrerebbe ridurre l’affinità delle βcatenine per APC, compromettendo l'assemblaggio del complesso necessario per la fosforilazione e degradazione delle βcatenine. Questo giustificherebbe la maggiore quantità di βcatenine nella linea cellulare che esprime la suddetta mutazione. I risultati ottenuti potrebbero fornire informazioni utili nella messa a punto di nuove terapie mirate.