Esplorare la complessità biologica dell’adenocarcinoma duttale pancreatico: dal crosstalk tumore-stroma alla regolazione della progressione tumorale e della chemiosensibilità mediata dai circRNA

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly lethal malignancy characterized by early invasion, pronounced chemoresistance, and a dense, hypoxic, acidic, and desmoplastic tumor microenvironment (TME). Given this context, we investigated how microenvironmental pH dynamics, extracellular matrix (ECM) composition, ion transporters, epigenetic regulators, and circular RNAs collectively contribute to malignant traits using 3D organotypic culture models that mimic PDAC evolution. Specifically, in non-malignant human pancreatic ductal epithelial (HPDE) cells, we observed that branching morphogenesis is strongly influenced by ECM composition and extracellular pH (pHe), with Matrigel-rich ECM promoting duct-like structures, and Collagen I-rich ECM impairing ductal architecture. Moreover, acidic pHe induced a hyper-branched phenotype, further enhanced by inhibition of the Na⁺/H⁺ exchanger 1 (NHE1), highlighting the role of NHE1 in regulating ductal architecture. In parallel, in cancer stem cells (CSCs), extracellular acidosis enhanced vasculogenic mimicry (VM) in an NHE1-dependent manner and promoted CSC marker expression. VM was maximal in early tumor-like, Matrigel-rich ECM and progressively decreased with increasing Collagen I content, whereas stepwise acidification enabled VM even in restrictive matrices. Mechanistically, VM induction required extracellular Ca²⁺ influx and subsequent intracellular Ca²⁺ increase. Furthermore, acidic and hypoxic conditions enhanced invadopodia-mediated ECM degradation and reduced PDAC cell sensitivity to GEM. Interestingly, comparison with the lipophilic GEM prodrug, GEM-C18, revealed superior cytotoxicity and stronger inhibition of invadopodia activity, particularly under acidic and hypoxic conditions. Additionally, at the epigenetic level, lysine-specific demethylase 1 (LSD1) and flavin adenine dinucleotide synthase isoform 2 (FADS2) were concomitantly upregulated in mutant p53-expressing PDAC cells, with direct protein-protein interaction supporting the importance of FAD synthesis and delivery to LSD1 in tumor progression. Finally, we identified a circular RNA, circBFAR, as a critical regulator of PDAC malignancy. circBFAR was overexpressed in PDAC parenchymal cells (CPCs) and further enriched in CSCs, particularly on a Matrigel-rich ECM. On this matrix, knockdown of circBFAR reduced cell viability, increased cell death, and sensitized both CPCs and CSCs to GEM-C18, while also decreasing invadopodia-mediated ECM degradation in CPCs. Collectively, our findings highlight the integrated role of tumor acidosis, ECM remodeling, ion transport, epigenetic regulation, and circRNA signaling in orchestrating PDAC aggressiveness. Accordingly, circBFAR emerges as a promising therapeutic target to enhance GEM-C18 efficacy, reduce invasiveness, and overcome chemoresistance, providing new insights into mechanisms driving PDAC progression.

L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una neoplasia altamente letale caratterizzata da invasione precoce, marcata chemioresistenza e da un microambiente tumorale (TME) denso, ipossico, acido e desmoplastico. In questo contesto, abbiamo studiato come le dinamiche del pH del microambiente, la composizione della matrice extracellulare (ECM), i trasportatori ionici, i regolatori epigenetici e gli RNA circolari contribuiscano congiuntamente alle caratteristiche maligne, utilizzando modelli di coltura organotipica 3D che mimano l’evoluzione del PDAC. In particolare, nelle cellule epiteliali duttali pancreatiche umane non maligne (HPDE), abbiamo osservato che il branching morphogenesis è fortemente influenzato dalla composizione dell’ECM e dal pH extracellulare (pHe): un’ECM ricca di Matrigel promuove la formazione di strutture simil-duttali, mentre un’ECM ricca di Collagene I compromette l’architettura duttale. Inoltre, un pHe acido induceva un fenotipo iper-ramificato, ulteriormente potenziato dall’inibizione dello scambiatore Na⁺/H⁺ di tipo 1 (NHE1), evidenziando il ruolo di NHE1 nella regolazione dell’architettura duttale. Parallelamente, nelle cellule staminali tumorali (CSC), l’acidosi extracellulare aumentava il mimetismo vascolare (VM) in modo NHE1-dipendente e promuoveva l’espressione dei marcatori delle CSC. La VM risultava massima in un’ECM ricca di Matrigel, simile a stadi tumorali precoci, e diminuiva progressivamente con l’aumento del contenuto di Collagene I, mentre un’acidificazione graduale consentiva la VM anche in matrici più restrittive. Meccanisticamente, l’induzione della VM richiedeva l’ingresso di Ca²⁺ extracellulare e il conseguente aumento del Ca²⁺ intracellulare. Inoltre, condizioni di acidità e ipossia potenziavano la degradazione dell’ECM mediata dagli invadopodi e riducevano la sensibilità delle cellule di PDAC alla gemcitabina (GEM). Interessante notare che il confronto con il profarmaco lipofilo della GEM, GEM-C18, ha evidenziato una maggiore citotossicità e un’inibizione più marcata dell’attività degli invadopodi, in particolare in condizioni acide e ipossiche. A livello epigenetico, la lisina-specifica demetilasi 1 (LSD1) e la flavina adenina dinucleotide sintasi isoforma 2 (FADS2) risultavano concomitantemente sovraregolate nelle cellule di PDAC esprimenti p53 mutato, con un’interazione diretta proteina-proteina che supporta l’importanza della sintesi e del trasferimento di FAD a LSD1 nella progressione tumorale. Infine, abbiamo identificato un RNA circolare, circBFAR, come regolatore cruciale della malignità del PDAC. circBFAR era sovraespresso nelle cellule parenchimali di PDAC (CPC) e ulteriormente arricchito nelle CSC, in particolare su un’ECM ricca di Matrigel. Su questa matrice, il knockdown di circBFAR riduceva la vitalità cellulare, aumentava la morte cellulare e sensibilizzava sia le CPC sia le CSC a GEM-C18, riducendo inoltre la degradazione dell’ECM mediata dagli invadopodi nelle CPC. Complessivamente, i nostri risultati evidenziano il ruolo integrato dell’acidosi tumorale, del rimodellamento dell’ECM, del trasporto ionico, della regolazione epigenetica e del segnale mediato dai circRNA nell’orchestrare l’aggressività del PDAC. Di conseguenza, circBFAR emerge come un promettente bersaglio terapeutico per potenziare l’efficacia di GEM-C18, ridurre l’invasività e superare la chemioresistenza, fornendo nuove prospettive sui meccanismi alla base della progressione del PDAC.