Definizione di un protocollo per la caratterizzazione morfologica e molecolare del genere Daldinia Ces. & De Not. (Ascomycota) in Sicilia

La possibilità di chiarire la tassonomia di alcuni complessi di specie come nel caso di Daldinia Ces. De Not. (1) per mezzo di indagini sia morfologiche che molecolari, permette un’esatta definizione dei taxa sulla base delle loro caratteristiche biologiche ed ecologiche. In un precedente studio (2) , effettuato sulla base dei caratteri teleomorfici ed anamorfici, sono stati descritti due taxa nuovi per la Scienza provenienti dal territorio siciliano: Daldinia martinii M. Stadler, Venturella & Wollweber e D. raimundi M. Stadler, Venturella & Wollweber. In questo contributo le stesse entità ed altri campioni di Daldinia di provenienza siciliana sono state analizzate con tecnologie differenti che hanno permesso sia l’osservazione al SEM dei profili morfologici delle ascospore, confermando le precedenti osservazioni (2), sia l’analisi molecolare (3) che ha previsto l’estrazione del DNA genomico dalle ascospore; l’amplificazione mediante la reazione a catena della polimerasi di specifiche sequenze bersaglio del genoma fungino; il sequenziamento dei prodotti di PCR e allineamento con le sequenze depositate nelle GenBank, la verifica delle relazioni filogenetiche e costruzione del relativo dendrogramma. Per l’estrazione del DNA genomico dalle ascospore sono stati utilizzati diversi protocolli, sia di laboratorio sia commerciali, e per facilitare la lisi delle ascospore di Daldinia è stato effettuato un pre-trattamento con microonde (4), in modo da rompere la resistente struttura della parete sporale preservando, al tempo stesso, l’integrità dell’acido nucleico. Le molecole di DNA genomico sono state utilizzate come stampo per le successive reazioni di PCR in cui sono stati utilizzati i primers ITS, sia universali sia “fungal specific”. I prodotti di amplificazione ITS sono stati sequenziati ricorrendo al MWG-Biotech Custom Sequencing Services, Germania (http://www.mwg-biotech.com) e le sequenze ottenute sono state confrontate con quelle presenti nella banca dati mediante la piattaforma BLAST. Le sequenze delle regioni ITS, dopo essere state messe a confronto con quelle presenti in banca dati, sono state allineate con il programma Clustal W e quindi sottoposte ad analisi cluster con i programmi Dnadist e Neighbor-joining del pacchetto Philip. I risultati hanno permesso di: i) individuare il protocollo di estrazione più idoneo, quindi la metodologia che, dopo un pre-trattamento delle spore con microonde, ha permesso l’estrazione del DNA genomico in quantità sufficienti per le successive analisi; ii) delineare il profilo di amplificazione PCR più idoneo, utilizzando primer diversi e saggiando (ricorrendo al Mastercycler-gradient, Eppendorf) un ventaglio di temperature di annealing, al fine di definirne la più specifica; iii) stabilire il grado di omologia dei campioni oggetto dello studio, quindi le relazioni filogenetiche tra essi definendo il relativo dendrogramma ottenuto dall’analisi delle sequenze nucleotidiche.