Polimorfismo e metilazione del dna: un suo possibile ruolo nella risposta allo stress termico di Capnodis tenebrionis

Le larve di Capnodis tenebrionis (L.) (Coleoptera: Buprestidae) infestano le radici di drupacee causandone spesso la morte. Ciascuna femmina depone oltre un migliaio di uova nel suolo presso il colletto e nei primi millimetri di profondità. La temperatura influenza ampiamente la fisiologia dell’adulto, il conseguimento della maturità sessuale, la fertilità e altre attività e comportamenti delle larve e dell’adulto. In generale possiamo dire che queste sofisticate risposte metaboliche, si articolano principalmente attraverso variazioni della espressione genica e, non meno importanti, anche dall'attivazione di meccanismi epigenetici. La metilazione del DNA, in quanto uno dei meccanismi epigenetici, è parte integrante della risposta degli esseri viventi agli insulti ambientali. Anche per gli insetti vale il dogma che l'abilita' di alterare rapidamente e reversibilmente i pattern d'espressione di numerosi geni, è la chiave della flessibilità della risposta all'ambiente circostante. Non potendo disporre di alcuna informazione specifica sul DNA del buprestide e volendo saggiare la risposta epigenetica allo stress termico e nonché alla ovo-deposizione si è deciso di applicare la tecnica RAPD per identificare sonde genomiche in grado di osservare polimorfismi sul DNA di insetti sottoposti a blando stress termico. Adulti di C. tenebrionis sono stati prelevati da Mariotto (Ba) e Ripalta (FG) nel settembre 2010 e allevati in condizioni controllate (23 o 28±1°C, 16 ore di luce e 8 ore di buio, UR 60±10%) per una settimana. Gonadi di maschi e femmine, selezionati in base alla temperatura di allevamento e al sesso, sono state destinate all’estrazione del DNA genomico. Per la tecnica RAPD sono stati utilizzati 44 primers OPERON delle serie OPY, OPU, OPW e OPX. Inizialmente, è stato saggiato il DNA genomico dei maschi allevati a 28°C. Dai primi esiti è stato possibile selezionare 18 primers in base ai profili elettroforetici con il maggior numero di bande di restrizione. Nelle successive analisi, i primers selezionati sono stati saggiati sul DNA genomico tal quale e su DNA, digerito con le endonucleasi di restrizione HpaII e MspI (enzimi sensibili alla metilazione), di femmine allevate a 28 o 23°C. Sono stati scelti i profili RAPD che presentavano differenze tra DNA tal quale e DNA digerito, riducendo il numero dei primers a due (OPY8 e OPY12). I risultati del polimorfismo di banda sono stati confermati anche saggiando OPY8 e OPY12 sul DNA genomico dei maschi e delle femmine allevati sia a 28 che a 23°C. In questo modo le bande di DNA individuate sono state clonate e avviate al sequenziamento. Il DNA di tutti gli insetti precedentemente trattati è stato poi, digerito con due differenti coppie di enzimi di restrizione sensibili alla metilazione e ibridato con le sonde precedentemente isolate, tramite tecnica Southern, al fine di ottenere un overview degli eventuali siti genomici di C. tenebrionis differentemente metilati.